【生物工程】基于酶法延伸的寡糖自動化合成

2019年03月11日 反應釜設備 40 views

注:文末有本文科研思路分析

核酸、蛋白質和糖是生命體內的三大主要聚合物大分子。對這些生物大分子的研究有助于揭示生命體的各種生理和病理現象,同時,核酸、蛋白質(多肽)和糖在醫藥工業上還具有很多重要的應用。因此,怎樣大量高效地獲得這些生物大分子成為無數研究者追求的目標。目前,核酸與多肽的自動合成技術平臺已經成熟。通過使用商業化的核酸與多肽合成儀,非專業合成科研人員也可以很方便地合成大量的核酸與多肽。自動化合成技術的發展極大地促進了相關學科的發展,同時催生了大批核酸和蛋白藥物。

然而不像核酸和蛋白,寡糖的組成單體并非由少數幾種殘基以固定的方式連接而成。組成寡糖的單糖種類以及單糖之間的連接方式極其多樣,導致寡糖的合成遠比核酸和蛋白的合成困難,這也是至今尚無成熟的商業化自動合成平臺可以用來合成寡糖的直接原因。目前化學法和酶法是合成寡糖的主要方法?;瘜W法可以通過對化學合成路線的設計來合成天然存在的或者非天然存在的寡糖。酶法合成主要是利用糖基轉移酶實現寡糖的逐步延伸。近些年來,德國馬普研究所的Seeberger教授課題組開發了基于化學法延伸的寡糖自動合成平臺,實現了對大量寡糖的自動化合成。但是化學合成需要種類繁多的單糖模塊,反應步驟需要大量的保護和去保護操作,導致反應效率低下,糖苷鍵的構型控制也很復雜,這些限制了寡糖合成儀的推廣使用。相對于化學法,酶法合成寡糖條件溫和,不需要保護和去保護的操作,更重要的是僅使用少量的糖基轉移酶通過簡單的排列組合便可以合成數以千計的寡糖。人類基因組中大約有二百多種糖基轉移酶,負責細胞表面大量寡糖分子的合成(保守估計人類細胞表面有幾萬種糖類分子)。因此,開發基于酶法合成的寡糖自動合成平臺有著廣闊的應用前景。實現基于酶法的寡糖自動合成延伸的核心問題就是將每一步酶催化的反應產物分離出來,參與下一步酶催化的延伸反應。毫無疑問,固相合成分離技術是解決這一問題的理想技術方案。核酸和多肽的自動合成正是基于固相合成分離才實現了自動化延伸。目前研究較多的基于化學延伸的寡糖自動化合成也是利用固相合成技術,然而當寡糖連接到固相載體上時,大多數糖基轉移酶或者寡糖水解酶并不能識別或者反應效率大大降低,主要是因為酶催化的反應在水相中進行。

近日,佐治亞州立大學王鵬教授和文留青博士帶領的研究團隊利用溫敏樹脂成功實現了基于酶法寡糖的自動合成。在該研究中,作者將寡糖延伸的起始引物(一般為單糖或者二糖)與一種溫敏材料(Poly(N-isopropylacrylamide,PNIPAM)連接。當環境溫度低于臨界溶解溫度(LCST),PNIPAM可以同水分子形成氫鍵,樹脂由此可以溶于水中,不會影響糖基轉移酶對底物的識別,酶反應順利進行。當溫度升高至高于臨界溶解溫度,這種分子間的氫鍵就會斷裂,樹脂聚集形成分子內的氫鍵從水相中沉淀出來(圖1)。這樣就可以像固相分離一樣將樹脂以及與樹脂相連接的寡糖產品分離,用于下一步延伸反應。該溫度控制的過程可以通過簡單改造過的多肽合成儀(Liberty Blue多肽合成儀)實現。糖基轉移酶與其他反應原料(金屬離子、糖核苷酸等)可以儲存在存放氨基酸的試管中。反應過程以及分離純化過程在反應釜中由微波加熱器通過調節溫度進行控制(圖2)。

圖1. PNIPAM溶解與沉淀原理示意圖

圖2. liberty blue多肽合成儀

該系統簡單易懂,同時易于操作,裝載有初始寡糖的樹脂預先加入到反應釜中,合成儀自動將糖基轉移酶與其他試劑加入反應釜中,在25 ℃下進行酶反應,當反應完成,開啟微波加熱,將體系溫度升高至90 ℃,帶有寡糖的樹脂從水溶液中沉淀,加壓過濾除去其余試劑,由此完成一個循環(圖3)。通過設置,他們可以將不同的糖基轉移酶與對應的糖核苷依次進行同樣的循環反應,多個循環后就可以得到目標寡糖,然后將寡糖從樹脂上洗脫。作者選擇了5種重要的復雜寡糖來測試該自動合成系統,成功實現了5 mg到20 mg規模的自動合成。

圖3. 酶法自動合成寡糖的基本原理

這一成果近期發表在Angewandte Chemie International Edition?上,并被選為hot paper和目錄首頁。文章的第一作者是佐治亞州立大學的博士研究生張家彬,通訊作者是王鵬教授和文留青博士。

該論文作者為:Jiabin Zhang, Congcong Chen, Madhusudhan Reddy Gadi, Christopher Gibbons, Yuxi Guo, Xuefeng Cao, Garrett Edmunds, Shuaishuai Wang, Ding Liu, Jin Yu, Liuqing Wen, Peng G. Wang

Machine‐Driven Enzymatic Oligosaccharide Synthesis by Using a?Peptide Synthesizer

導師介紹

王鵬

文留青

科研思路分析

Q:這項研究最初是什么目的?或者說想法是怎么產生的?

A:多肽與寡核苷酸合成儀的廣泛使用可以讓非專業人員大量生產多肽與寡核苷酸,極大促進了現代生物學與藥學的發展。我們的目的是設計開發一臺同多肽與寡核苷酸合成儀相似的、可用與全自動酶法糖合成的商用儀器,其能夠讓非專業人員經過短暫的培訓用以合成寡糖。

Q:研究過程中遇到哪些挑戰?

A:該課題最大的難點是以往的研究發現采用與自動合成多肽與寡核苷酸相同的固相合成法,酶反應的轉化率不理想。反應中的酶和固相樹脂之間識別困難。同時,許多課題組發現水溶性的樹脂能夠完美地進行酶反應,但是水溶性的樹脂增加了反應后的純化難度。因此,我們課題組采用上述溫敏材料完美解決了這兩個難題。

Q:該研究成果可能有哪些重要的應用?哪些領域的企業或研究機構可能從該成果中獲得幫助?

A:該研究提供了一種新的思路用以自動合成寡糖。這種儀器可以合成化學法難以合成的天然存在的寡糖,與人工酶法合成寡糖相比,機器可以不停地工作,同時簡化了純化環節,可大量生產具有生物活性的寡糖用以生理藥理的研究。因此,這種儀器可以極大地促進糖科學的發展,同時讓生物與醫藥行業受益。

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